【背景介紹】 慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種常見的呼吸系統(tǒng)疾病，它具有高發(fā)病率和死亡率，嚴(yán)重時(shí)可能導(dǎo)致肺功能進(jìn)行性減退、呼吸衰竭和肺源性心臟病等問題。為了研究COPD的發(fā)病機(jī)制、尋找有效的治療方法，建立動(dòng)物模型是科研工作的有效工具。   【實(shí)驗(yàn)材料和方法】 *實(shí)驗(yàn)材料： C57小鼠(雄性，6-8周);香煙(廠家：紅河) *造模方法： 1：適應(yīng)性喂養(yǎng)7天，用熏煙的方法將小鼠置于自制吸煙染毒箱內(nèi)，箱體的頂部有1.5X1.5cm的小孔，保持箱體內(nèi)空氣與箱外保持相通。 2：點(diǎn)燃紅河牌香煙(焦油量11mg，煙氣煙堿量1.0mg，煙氣一氧化碳量13mg)，放入染毒箱內(nèi)，關(guān)閉染毒箱，1小時(shí)后將老鼠取出，休息15min后，再次點(diǎn)燃香煙，將老鼠繼續(xù)放置染毒箱1小時(shí)，每天熏煙1次，每次2小時(shí)，每周連續(xù)熏煙6天，造模20周后取材，做HE染色。 *評(píng)價(jià)指標(biāo)： 肺泡灌洗液炎癥因子檢測(cè)，HE染色。   【驗(yàn)證】 肺泡灌洗液炎癥因子檢測(cè) HE染色 HE染色結(jié)果：正常組小鼠肺組織肺泡壁結(jié)構(gòu)連續(xù)，相對(duì)完整。模型組支氣管壁及周圍炎細(xì)胞浸潤(rùn)，上皮細(xì)胞脫落，呈絨毛狀增生;肺間質(zhì)和肺泡腔炎細(xì)胞浸潤(rùn)，個(gè)別視野大量出血，肺間質(zhì)明顯增生;肺泡正常結(jié)構(gòu)破壞，部分肺泡斷裂，相互融合形成較大的泡腔。

【背景介紹】 肺纖維化是一種慢性、進(jìn)行性的肺部疾病，其特征是肺組織的異常修復(fù)導(dǎo)致肺泡結(jié)構(gòu)的破壞和纖維化。為了研究肺纖維化的發(fā)病機(jī)制、病理過程以及藥物的療效，建立與人肺纖維化病理過程相似的動(dòng)物模型尤為重要。   【實(shí)驗(yàn)材料和方法】 *實(shí)驗(yàn)材料： SD大鼠（雄性，180-220g）；博萊霉素（MCE，HY-17565A） *造模方法： 1. 適應(yīng)性喂養(yǎng)7天，動(dòng)物麻醉機(jī)混合純氧進(jìn)行麻醉。剃毛機(jī)剃除老鼠頸部毛發(fā)，碘伏消毒。 2. 剝離氣管，經(jīng)氣管注入5mg /kg的博萊霉素溶液，注射完畢后立即將大鼠直立旋轉(zhuǎn)30秒，盡量使藥液向下流入肺內(nèi)時(shí)能夠均勻分布，然后將大鼠輕輕放回籠中，使大鼠平躺，自然清醒。正常飲食，造模后4~5周后取材,做HE染色和Masson染色。 *評(píng)價(jià)指標(biāo)： 肺組織生化檢測(cè)，Masson染色，HE染色。   【驗(yàn)證】 肺組織生化檢測(cè) Masson染色 Masson染色結(jié)果：與正常組相比，模型組肺組織大量膠原纖維增生，被染成藍(lán)色；肺泡壁明顯增厚，肺泡結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，肺泡腔縮小變實(shí)；肺泡和間質(zhì)纖維化，有膠原沉積。  HE染色  ?HE染色結(jié)果：與正常組相比，模型組肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔縮小或消失；肺泡間隔和肺泡腔可見大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；肺泡壁增厚，間隔增寬。

【背景介紹】        血管形成是腫瘤發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移的重要條件，其中腫瘤細(xì)胞自身分泌的生長(zhǎng)因子可以誘導(dǎo)血管生成。惡性腫瘤通常伴有快速增長(zhǎng)和密集的血管，抑制血管生成可以有效地阻止腫瘤組織的生長(zhǎng)和擴(kuò)散，體外血管生成實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚰M腫瘤的血管發(fā)生過程，并且適用于研究藥物對(duì)此過程的影響。   【血管形成實(shí)驗(yàn)】 01 實(shí)驗(yàn)原理 內(nèi)皮細(xì)胞保留了分裂和快速遷移的能力，可響應(yīng)血管生成信號(hào)。 02 血管形成一般使用哪些細(xì)胞？ 多種類型的內(nèi)皮細(xì)胞均可用于本實(shí)驗(yàn)，包括原代細(xì)胞和永生化細(xì)胞系。常用的有“人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）”，之所以不采用靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞與動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞是因?yàn)镠UVEC具有干細(xì)胞的潛能，理論上可以傳代50-60次。此外小鼠3B-11細(xì)胞、小鼠SVEC4-10細(xì)胞或原代內(nèi)皮細(xì)胞也可用于血管形成實(shí)驗(yàn)。 03 實(shí)驗(yàn)操作步驟 a.實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備與材料： 實(shí)驗(yàn)前一天將Matrigel置于冰盒中，放入冰箱過夜，4℃溫度，使膠緩慢融化。同樣提前將槍頭、EP管、96孔板放入4℃度冰箱中預(yù)冷。 b.分裝： 將凍融的Matrigel進(jìn)行分裝，并用預(yù)冷槍頭混勻，以300ul/管分裝到EP管中，整個(gè)過程始終是在冰盒中進(jìn)行。 c.鋪膠： 將96孔板放在冰盒上，以每孔50ul把基質(zhì)膠加到96孔板內(nèi)，避免產(chǎn)生氣泡，加完稍微搖晃均勻放在4℃冰箱中靜置20-30min，再放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中1h等待凝固。 d.收集： 當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞達(dá)到80%時(shí)匯合度后準(zhǔn)備消化，收集細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并按照稀釋調(diào)整細(xì)胞的密度（初次實(shí)驗(yàn)設(shè)置細(xì)胞密度建議：3~10*10^4細(xì)胞）。 e.觀察： 96孔板加入100ul的細(xì)胞懸液，做好標(biāo)記后放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。四小時(shí)后可見血管形成。在鏡下觀察并拍照，時(shí)間為14~18h。結(jié)果分析。       【常見問題及解答】 1.如何正確加入基質(zhì)膠？ 手持移液槍垂直于96孔板內(nèi)孔的正上方，將基質(zhì)膠滴入孔底部，防止基質(zhì)膠沾到孔壁上。若孔底部沒有鋪勻，可晃動(dòng)孔板使其均勻鋪于底部。 2.血管形成實(shí)驗(yàn)，應(yīng)選用多大濃度的基質(zhì)膠呢？ 最低濃度應(yīng)不低于10mg/mL，基質(zhì)膠的稀釋比例是6mg/mL以上。成管效果最好的是6~8mg/mL。 3.血管形成實(shí)驗(yàn)應(yīng)選哪種凝膠基質(zhì)？ 內(nèi)皮細(xì)胞的管形成率取決于形成基底膜樣細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)表面的凝膠的類型和成分，細(xì)胞在該表面上接種。  

【背景介紹】 急性肺損傷(acutelunginjury，ALI)是由非心源性的各種嚴(yán)重肺內(nèi)外致病因素如嚴(yán)重感染休克、創(chuàng)傷、DIC、誤吸等原發(fā)疾病引起，臨床主要表現(xiàn)為急性進(jìn)行性加重的呼吸困難和難治性低氧血癥，進(jìn)一步發(fā)展可演變?yōu)榧毙院粑狡染C合征(ARDS)。肺是這一過程中最易受損的首位靶器官，制備穩(wěn)定的動(dòng)物模型對(duì)觀察ALl 病理改變，探究潛在藥物作用機(jī)制，防治并發(fā)癥等具有重要意義。   【實(shí)驗(yàn)材料和方法】 *實(shí)驗(yàn)材料： 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：Balb/c小鼠(雄性，8周) 外源因子：LPS(sigma，L2630) *造模方法： 1.以阿佛丁0.2ml/10g對(duì)小鼠腹腔麻醉后，將小鼠四肢固定于泡沫板上，剃除頸部毛發(fā)，碘伏消毒，頸部切開，暴露氣管。 2.采用氣管插管的方式向小鼠氣管內(nèi)滴注LPS(5mg /kg)，氣管滴注后將小 鼠直立，防止脂多糖逆流。 3.造模至少24h后取各組小鼠肺組織，HE染色觀察病理變化。 *評(píng)價(jià)指標(biāo)： 1.肺干/濕比 2.組織切片：進(jìn)行HE染色以觀察病理變化。   【驗(yàn)證】 *肺干/濕比 *HE染色                     正常組                                                  模型組 HE染色結(jié)果：與正常組相比，模型組肺組織肺泡壁厚度增加，肺泡腔縮小，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

【背景介紹】 膿毒癥是指因感染引起的反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙，可累及多個(gè)臟器，導(dǎo)致臟器官功能損害或衰竭。膿毒癥已成為常見的多發(fā)危重疾病，對(duì)人類健康構(gòu)成了巨大威脅。動(dòng)物疾病模型的建立有助于人們更好地探討膿毒癥的發(fā)病機(jī)制和尋找有效的治療措施。 膿毒癥造模的方法主要有3種，包括大腸桿菌感染型、脂多糖誘導(dǎo)型、盲腸結(jié)扎型。最廣泛使用的膿毒癥模型是盲腸結(jié)扎模型，該模型被認(rèn)為與人類膿毒癥具有顯著相容性。盲腸結(jié)扎模型的主要優(yōu)點(diǎn)是腹膜通過與失活組織結(jié)合而接種了來自動(dòng)物本身的混合微生物菌群。在盲腸結(jié)扎后，會(huì)產(chǎn)生類似于人類敗血癥的免疫、血流動(dòng)力學(xué)和生化反應(yīng)。   【造模方法及驗(yàn)證】 1. 實(shí)驗(yàn)材料和方法 *實(shí)驗(yàn)材料：SD大鼠（雄性，6-8周） *造模方法： 1. 以10%水合氯醛（300mg/kg）對(duì)大鼠腹腔麻醉后腹腔注射麻醉大鼠，麻醉滿意后大鼠無翻正反射，以碘伏常規(guī)消毒腹部區(qū)域，鋪無菌洞巾。 2. 沿腹正中線作一長(zhǎng)約1cm縱行切口，用無菌鑷探查并拖出暴露盲腸。 3. 在距盲腸盲端2cm處用無菌4號(hào)絲線結(jié)扎盲腸，用20G套管針將盲腸盲端貫通穿孔2次，避免損傷腸系膜及盲腸血管。 4. 擠出少許糞便后回納腹腔，逐層縫合腹壁切口。 5. 造模至少24h后取各組大鼠肝、腎組織，HE染色觀察病理變化。 *評(píng)價(jià)指標(biāo)：動(dòng)物行為學(xué)描述，HE染色。   2. 驗(yàn)證 *動(dòng)物行為學(xué)描述 與正常組大鼠相比，模型組大鼠毛發(fā)臟、亂、無光澤，嘴和眼角會(huì)出現(xiàn)膿性分泌物，厭食、反應(yīng)遲鈍，體溫低等現(xiàn)象。   *HE染色（肝） *HE染色結(jié)果：與假手術(shù)組相比，模型組肝組織結(jié)構(gòu)異常，有典型的脂肪變性空泡。   *HE染色（腎） *HE染色結(jié)果：與假手術(shù)組相比，模型組腎組織結(jié)構(gòu)異常，腎小球皺縮，腎小管損傷，有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

貼壁細(xì)胞總蛋白提?。? 用TBS緩沖液潤(rùn)洗貼壁細(xì)胞2-3次，最后一次盡量吸干殘留液。加入適當(dāng)體積的細(xì)胞總蛋白提取試劑(使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑)于培養(yǎng)板/瓶?jī)?nèi)裂解3-5min。期間反復(fù)晃動(dòng)培養(yǎng)板/瓶，使試劑與細(xì)胞充分接觸。用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞及試劑刮下，收集到1.5mL離心管中。冰浴30min，期間用移液器反復(fù)吹打，確保細(xì)胞完全裂解。4℃13000g離心5min，收集上清，即為總蛋白溶液。 懸浮細(xì)胞總蛋白提?。? 低速離心收集細(xì)胞，加入適當(dāng)體積的冷卻的PBS緩沖液重懸，2000rpm離心10min，吸除上清。重復(fù)以上操作兩次，收集細(xì)胞沉淀。加入適當(dāng)體積的細(xì)胞總蛋白提取試劑(使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑)，振蕩。冰浴30min，期間用移液器反復(fù)吹打，確保細(xì)胞完全裂解。4℃13000g離心5min，收集上清，即為總蛋白溶液。 組織總蛋白提?。? 組織塊用預(yù)冷的PBS緩沖液漂洗2-3次，去除血污，剪成小塊置于勻漿器中。加入10倍于組織體積的組織蛋白提取試劑(使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑)，冰浴徹底勻漿。將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，振蕩。冰浴30min，期間用移液器反復(fù)吹打，確保勻漿液完全裂解。4℃13000g離心5min，收集上清，即為總蛋白溶液。 胞漿胞核蛋白提?。? 收集細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于適當(dāng)體積的漿蛋白提取試劑(使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑)中，振蕩混勻15 秒，使細(xì)胞完全懸浮并分散開。如果細(xì)胞沉淀沒有完全懸浮并分散開，可以適當(dāng)延長(zhǎng)振蕩混勻時(shí)間。冰浴30 min。高速振蕩混勻5 秒，4℃13000g 離心10 min。吸取上清至一預(yù)冷的離心管中，即為細(xì)胞漿蛋白。吸盡上清(上清盡量去凈，避免漿蛋白污染)，加入適當(dāng)體積的核蛋白提取試劑(使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑)，高速振蕩混勻15 秒，使沉淀完全懸浮并分散開。冰浴30min，每隔5min劇烈振蕩混勻10～20s， 4℃13000g離心10 min。吸取上清至一預(yù)冷的離心管中，即為細(xì)胞核蛋白。