背景介紹 心力衰竭（HF）是由于心臟結(jié)構(gòu)或功能性疾病導(dǎo)致心室充盈或射血能力受損的一組復(fù)雜臨床綜合征，其發(fā)病率和病死率逐年增高，嚴(yán)重危害人類身體健康。其主要臨床表現(xiàn)為呼吸困難、乏力，以及肺瘀血和外周水腫。心力衰竭的發(fā)病機(jī)制和干預(yù)治療的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床要求，這就需要建立成熟穩(wěn)定的心力衰竭動物模型來了解疾病進(jìn)程以及研究新的治療方法。   實(shí)驗(yàn)材料和方法 01 實(shí)驗(yàn)材料： SD大鼠（雄性，180-220g） 異氟烷（廠家：瑞沃德 型號：R510-22-10） 動物呼吸機(jī)（廠家：上海奧爾科特生物 型號：ALC-V8S） 通用型小動物麻醉機(jī)（廠家：瑞沃德 型號：R580S）   02 造模方法： 適應(yīng)性喂養(yǎng)7天，運(yùn)用異氟烷和脂肪乳混合做成乳化異氟烷的方式，腹腔注射麻醉大鼠。 頸部剪開，鈍性分離出氣管，經(jīng)口插管，連接呼吸機(jī)，用先調(diào)整好的參數(shù)（大鼠呼吸頻率80，吸呼比1：1，潮氣量6.4） 鈍性分離胸腔左側(cè)肌肉，暴露肋間，從第3肋和第4肋間撕開肌肉，暴露心臟，輕輕撕開一點(diǎn)心包膜，用6-0帶線縫合針于左心耳與動脈圓錐之間進(jìn)針，心電圖ST抬高表示結(jié)扎成功，之后縫合好肋間肌肉和胸腔肌肉，過5-10分鐘撤掉呼吸機(jī)，待老鼠恢復(fù)自主呼吸，放置于籠內(nèi)。 造模完成之后4-8w取材心臟組織。   03 評價指標(biāo)： 血清指標(biāo)ELISA檢測，Masson染色，HE染色   驗(yàn)證 血清指標(biāo)ELISA檢 Masson染色    （左：正常組；右：模型組） Masson染色結(jié)果：正常組大鼠心肌組織基本呈紅色，無明顯藍(lán)色膠原纖維化組織。模型組心肌纖維化較嚴(yán)重，大量膠原纖維增生，可見大片藍(lán)色心肌膠原沉積于心肌細(xì)胞及血管周圍。心肌細(xì)胞肥大，胞質(zhì)腫脹，排列紊亂。 HE染色    （左：正常組；右：模型組） HE染色結(jié)果：正常組大鼠心肌纖維排列整齊有序，心肌細(xì)胞形態(tài)正常、輪廓清晰。模型組心肌細(xì)胞間隙明顯增寬，有炎性細(xì)胞浸潤，間質(zhì)內(nèi)可見毛細(xì)血管擴(kuò)張?jiān)錾＜?xì)胞腫脹，邊界模糊不清，心肌細(xì)胞損傷嚴(yán)重，呈小灶狀或片狀壞死。

【背景介紹】 人胰腺癌以手術(shù)為主的綜合治療手段效果不好，術(shù)后轉(zhuǎn)移早，胰腺癌引起死亡的主要原因是胰腺癌引起的轉(zhuǎn)移性疾病，最常見的部位是肝臟。建立良好的肝癌動物模型對于模擬人體肝癌形成及抗腫瘤免疫應(yīng)答研究具有很好的替代作用。目前有皮下移植瘤、原位移植瘤和胰腺癌肝臟轉(zhuǎn)移瘤等眾多模型供科研應(yīng)用。   【實(shí)驗(yàn)材料和方法】 01 實(shí)驗(yàn)材料： C57小鼠（雄性，6-8周）、PancO2細(xì)胞（轉(zhuǎn)染熒光素酶）   02 造模方法： 配制成細(xì)胞懸液。 麻醉C57小鼠后，用0.5%的碘伏消毒。 脾臟下極的中部，緩慢注射入細(xì)胞懸液，可見脾包膜迅速鼓起、變白。 腫瘤成功轉(zhuǎn)移到肝并形成明顯病灶（時間為3周-4周），根據(jù)活體成像觀察胰腺及肝成瘤狀態(tài)。 周期結(jié)束及時取出肝臟組織，HE染色法檢測肝組織病理情況。   03 評價指標(biāo)： 活體成像，大體觀察，HE染色   【驗(yàn)證】 活體成像   大體觀察      HE染色 HE染色結(jié)果：肝腫瘤形狀為結(jié)節(jié)狀，異常增生形成局部腫塊，與周圍組織分界清楚。腫瘤細(xì)胞呈團(tuán)塊狀分布，異型性明顯。瘤區(qū)腫瘤細(xì)胞核大、數(shù)量多、染色深，部分視野可見核分裂、固縮，核仁肥大、數(shù)目增多。

【背景介紹】 腎缺血再灌注是一種用于模擬腎臟在缺血狀態(tài)下再恢復(fù)血流情況的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停@在醫(yī)學(xué)研究中對于理解腎臟損傷和修復(fù)機(jī)制非常重要。這種模型通常使用微型動脈夾來夾閉小鼠的雙側(cè)腎動脈來制備，可以觀察到腎功能和腎臟病理變化。   【實(shí)驗(yàn)材料和方法】 01 實(shí)驗(yàn)材料： C57小鼠（雄性，6-8周） 異氟烷（廠家：瑞沃德 貨號：R510-22-10） 通用型小動物麻醉機(jī)（廠家：瑞沃德 型號：R580S）   02 造模方法： 1、適應(yīng)性喂養(yǎng)7天，小動物麻醉機(jī)混合純氧進(jìn)行麻醉。 2、腹側(cè)皮膚剪開，暴露腎臟，直視下清晰顯露一側(cè)腎蒂，游離出一側(cè)腎動脈，觀察老鼠呼吸狀態(tài)，缺血期密切觀察腎臟顏色，,觀察腎臟顏色由鮮紅色變?yōu)榘导t色，結(jié)扎45min后松開線結(jié)，再灌注后，逐層縫合關(guān)腹。術(shù)后觀察小鼠狀態(tài)至小鼠蘇醒，再灌注后24h取材腎臟組織。   03 評價指標(biāo)： 腎臟缺血圖片，血清生化檢測，HE染色，Tunel（熒光）檢測   【驗(yàn)證】 腎臟缺血圖片   血清生化檢測 HE染色    （左：正常組；右：模型組） HE染色結(jié)果：與正常組相比，模型組組織結(jié)構(gòu)異常，腎間質(zhì)可見炎細(xì)胞浸潤。大量腎小管上皮細(xì)胞腫脹破裂，胞核消失，嚴(yán)重部位，細(xì)胞片狀壞死、脫落。部分腎小管擴(kuò)張，管腔內(nèi)大量脫落的上皮細(xì)胞碎片呈管型。   Tunel（熒光）檢測    （左：正常組；右：模型組） Tunel結(jié)果：DAPI以藍(lán)光表示，Tunel(+)以綠光表示。與正常組相比，模型組大量腎小管上皮細(xì)胞有明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。

免疫熒光染色   一、實(shí)驗(yàn)原理   1、免疫組化（Immunohistochemistry）原理：應(yīng)用免疫學(xué)基本原理，抗原與抗體特異性結(jié)合，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑顯色，以確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原，對其進(jìn)行定位、定性及相對定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。   2、分類：按照標(biāo)記物的種類可分為免疫熒光法、免疫酶法、免疫鐵蛋白法、免疫金法及放射免疫自顯影法等。   3、免疫熒光法（Immunofluorescence,IF）：將已知抗體標(biāo)上熒光素，作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原，在熒光顯微鏡下觀察，當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后會發(fā)出一定波長的熒光，以確定細(xì)胞或組織中的抗原定位或定量。   4、免疫熒光常見染料   顏色 染料 簡介 藍(lán)光 DAPI、Hoechst 可用于普通細(xì)胞核染色或細(xì)胞凋亡檢測 紅光 CY3、Rhodamine 激發(fā)波長550nm,發(fā)射波長570nm 綠光 CoraLite488、FITC 激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長515nm；激發(fā)波長492nm，發(fā)射波長520nm 遠(yuǎn)紅 Alexa Fluor 647 激發(fā)波長651nm，發(fā)射波長667nm   *示例圖： （左圖）IF常規(guī)：熒光單標(biāo)，DAPI藍(lán)+PCNA紅；（右圖）IF常規(guī)：熒光異源雙標(biāo)，DAPI藍(lán)+eNOS紅+GFAP綠 1）適用樣本：石蠟切片、細(xì)胞、冰凍切片 2）簡介：免疫熒光單標(biāo)、雙標(biāo)（2個抗體異源），可選擇標(biāo)記紅光或綠光，默認(rèn)DAPI染核呈藍(lán)光。   （左圖）IF同源雙標(biāo)：DAPI藍(lán)+GFAP綠+KAP1紅；（右圖）IF同源雙標(biāo)：DAPI藍(lán)+α-SMA綠+KAP1紅 1）適用樣本：石蠟切片（質(zhì)量較好不易掉片的樣本） 2）簡介：TYR-488綠光、TYR-CY3紅光兩種反應(yīng)液所染熒光比常規(guī)熒光二抗更亮、更強(qiáng)。   二、實(shí)驗(yàn)步驟   1、IF（石蠟切片）常規(guī)主要染色步驟： （注：孵育二抗選擇CY3、Rhodamine、CoraLite488、FITC等熒光染料標(biāo)記的二抗）   2、IF（石蠟切片）同源雙標(biāo)主要染色步驟：   *IF同源雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)原理簡介： 酪胺信號放大技術(shù)（TSA，Tyramide signal amplification），利用辣根過氧化酶（HRP）對靶蛋白進(jìn)行高密度原位標(biāo)記，提高檢測的靈敏度，大幅提高信噪比。TSA信號不受微波法影響，并能在抗體去除后保留信號的原理。通過順序染色，進(jìn)行各色標(biāo)記，先通過微波加熱去除上一輪抗體，再進(jìn)行下一輪染色檢測，而不必?fù)?dān)心上一波染色中抗體的干擾。因此，可以使用同一種屬來源的一抗進(jìn)行多色標(biāo)記。每一輪染色換用不同顏色標(biāo)記的TSA，可對切片質(zhì)量較好的石蠟切片樣本多重染色。    三、注意事項(xiàng)   1、樣本固定：4%多聚甲醛PFA，適用于絕大多數(shù)細(xì)胞、組織的固定，穿透力強(qiáng)，固定均勻，能使組織硬化，有利于切片。但眼球樣本，視網(wǎng)膜容易碎裂，結(jié)構(gòu)特殊，最好使用專用的混合型固定液，盡量保持樣本的完整性。 2、避光操作：因?yàn)闊晒馊玖峡赡軙銣?，所以染色過程中，加一抗前面那些步驟可正常不避光操作，但如果開始配制熒光二抗染料、孵育、染核、鏡檢、封片拍照等，這些步驟就都需要避光進(jìn)行操作，避免熒光減弱或淬滅。 3、通透處理：Triton X-100破膜液，作用原理是，可溶解細(xì)胞膜、核膜、細(xì)胞器膜上的脂質(zhì)，使需要的抗體或大分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進(jìn)入胞漿、細(xì)胞核。 4、熒光染料的選擇：紅光染料一般熒光比較亮、效價高，會優(yōu)先選擇；綠光染料，488系列可能會比FITC更亮、效價更高。 5、自發(fā)熒光：蘇丹黑B（Sudan Black B），配制成染液處理組織切片，可減弱組織樣本中，比如紅細(xì)胞，這種自發(fā)熒光，使熒光結(jié)果相對更有特異性。 6、熒光較弱：適當(dāng)調(diào)整孵育條件，比如提高一抗?jié)舛?、延長一抗孵育時間、提高二抗?jié)舛?、更換不同熒光標(biāo)記的二抗等等。 7、洗滌：吐溫80（Tween80），非離子型去污劑，可與PBS緩沖液配合使用洗滌，在免疫熒光染色中減少雜質(zhì)或渣滓。

【背景介紹】 裸鼠成瘤模型(Cell Derived Xenograft, CDX)是一種常用的腫瘤研究模型，它涉及將體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞直接注射到免疫缺陷小鼠(通常是裸鼠，即BALB/c-nu小鼠)體內(nèi)，以此模擬人類腫瘤的生物學(xué)特性，包括腫瘤的形成、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等過程。該模型廣泛應(yīng)用于抗腫瘤藥物的篩選和療效評估，幫助研究者了解藥物對腫瘤生長的抑制作用。   【實(shí)驗(yàn)材料和方法】 實(shí)驗(yàn)材料：BALB/c-nu小鼠(雄性，18-22g);Panc02細(xì)胞(5*10^6/200μL) 造模方法：1、適應(yīng)性喂養(yǎng)7天，每只裸鼠皮下注射癌細(xì)胞200μL。2、3-5天后觀察裸鼠皮下腫瘤生長情況，1周后每間隔兩天觀察記錄裸鼠皮下腫瘤生長狀況。3. 28天左右取材，HE染色。 評價指標(biāo)：動物大體圖及腫瘤拍照，腫瘤生長曲線，HE染色。   【驗(yàn)證】 動物大體圖 腫瘤拍照 腫瘤生長曲線 HE染色   HE染色結(jié)果：腫瘤細(xì)胞較小，呈圓形、卵圓形或短梭形，胞質(zhì)稀少，胞界不清，有少量腫瘤細(xì)胞核固縮，凋亡，壞死。

【背景介紹】        哮喘（Asthma）是一種慢性氣道炎癥性疾病，具有可變氣流阻塞、氣道高反應(yīng)性(AHR)和氣道炎癥等特征。哮喘的主要臨床癥狀是呼吸短促、氣喘、咳嗽以及接觸過敏原后粘液分泌增多。其發(fā)病是由遺傳、表觀遺傳和環(huán)境因素之間的復(fù)雜相互作用引起的。不同的病理改變由氣道上皮細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞亞群等多種參與免疫應(yīng)答的細(xì)胞介導(dǎo)，其中Th2細(xì)胞被認(rèn)為在高嗜酸性粒細(xì)胞型哮喘中占主導(dǎo)地位，伴隨細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13水平升高。經(jīng)典的哮喘模型是卵清蛋白（OVA）誘導(dǎo)的氣道炎癥模型，經(jīng)多次腹腔注射OVA致敏，霧化吸入OVA后激發(fā)，建立急性哮喘模型。   【實(shí)驗(yàn)材料和方法】 1.實(shí)驗(yàn)材料： SD大鼠（雄性，6-8周） 超聲霧化器（廠家：富林 貨號：W001） 卵清蛋白（廠家：麥克林 貨號：E6377） 氫氧化鋁（廠家：滬試 國藥編碼：20001060） 2.造模方法： 適應(yīng)性喂養(yǎng)7天，在第1天和第8天腹腔注射含10mg的卵清蛋白及200mg的氫氧化鋁的生理鹽水，在第15天開始用含1%卵清蛋白的生理鹽水霧化吸入激發(fā)，每天1次，每次 30 min，共14天，霧化結(jié)束取材肺組織。 3.評價指標(biāo)： 血清炎癥因子及IgE檢測，HE染色。   【驗(yàn)證】 血清炎癥因子及IgE檢測     HE染色     正常組                                                          模型組        HE染色結(jié)果：正常組肺組織肺泡結(jié)構(gòu)正常，支氣管上皮結(jié)構(gòu)基本完整，無明顯脫落。模型組肺組織肺泡壁明顯增厚，肺泡腔縮小，間隔增寬，結(jié)構(gòu)紊亂；支氣管、血管周圍，以及肺間質(zhì)可見大量炎細(xì)胞浸潤；支氣管平滑肌及基底膜明顯增厚，氣道杯狀細(xì)胞增生，氣道黏膜不規(guī)則增生，部分支氣管內(nèi)有上皮細(xì)胞脫落。