當(dāng)涉及到正常的生命生長和發(fā)育過程時(shí)，細(xì)胞遷移是重要的功能之一。它在傷口愈合、胚胎發(fā)育和血管生成等許多生理過程中扮演著關(guān)鍵角色。此外，細(xì)胞遷移也與免疫反應(yīng)及癌癥轉(zhuǎn)移等疾病有關(guān)。因此，細(xì)胞遷移的研究一直以來備受科研人員的關(guān)注與探索。今天我們就來講講細(xì)胞遷移研究中的常備技術(shù)——細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。   1. 實(shí)驗(yàn)原理 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)(cell wound healing assay)是一種用于評估細(xì)胞遷移能力的方法。在細(xì)胞單層上創(chuàng)建一個(gè)空白區(qū)域，稱為“劃痕”或“傷口”。劃痕邊緣的細(xì)胞逐漸進(jìn)入空白區(qū)域，導(dǎo)致劃痕愈合。在細(xì)胞遷移過程中，通過延時(shí)顯微鏡定期捕獲圖像，測量不同時(shí)間點(diǎn)的劃痕間距并計(jì)算差值，以評估細(xì)胞的遷移能力。     2. 操作步驟 01 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 準(zhǔn)備所需的細(xì)胞培養(yǎng)基和消毒液; 將培養(yǎng)皿/培養(yǎng)板在消毒柜或消毒器內(nèi)滅菌處理; 使用紫外線燈或其他消毒方式對操作區(qū)域進(jìn)行徹底消毒。 02 細(xì)胞培養(yǎng)： 培養(yǎng)所需的細(xì)胞株，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下培養(yǎng)至合適的密度; 將細(xì)胞收獲并進(jìn)行適當(dāng)?shù)碾x心處理，得到單個(gè)細(xì)胞的懸浮液。 03 細(xì)胞劃痕： 在消毒后的培養(yǎng)器皿內(nèi)用標(biāo)尺和標(biāo)記筆描繪出劃痕線，通常選擇一個(gè)明顯可見的標(biāo)記點(diǎn)，以方便后續(xù)觀察和測量; 使用一個(gè)尖端將細(xì)胞劃過預(yù)先描繪的劃痕線，以在培養(yǎng)皿/板上形成一個(gè)細(xì)胞劃痕; 注意保持器皿的穩(wěn)定和水平，以確保劃痕線的質(zhì)量和準(zhǔn)確性。 04 洗滌細(xì)胞： 用洗滌液(PBS)輕輕洗滌3次，去除劃痕線上的游離細(xì)胞; 注意不要過度沖洗，避免把劃痕區(qū)域的細(xì)胞一并移除。 05 細(xì)胞培養(yǎng)和觀察： 加入預(yù)先準(zhǔn)備好的無血清培養(yǎng)基; 將培養(yǎng)皿/板放入恒溫培養(yǎng)箱中，保持適宜的培養(yǎng)條件(37°C，5% CO2); 在預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)取出培養(yǎng)皿/板，并用顯微鏡觀察細(xì)胞在劃痕區(qū)域的遷移情況; 使用攝影技術(shù)記錄圖像，以備后續(xù)定量分析或比較。 06 細(xì)胞遷移分析： 使用圖像處理軟件(Image J)進(jìn)行圖像分析，測量劃痕區(qū)域內(nèi)細(xì)胞遷移的距離和速度; 根據(jù)需要進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和數(shù)據(jù)可視化，以獲得相關(guān)結(jié)果和結(jié)論。   3. 實(shí)驗(yàn)常見問題及解決方案 Q: 細(xì)胞劃痕線不均勻，線不直或?qū)挾炔灰恢? A: 使用專門的劃痕裝置 6 孔板來確保劃痕的準(zhǔn)確性。因?yàn)?孔板可以保證有相當(dāng)距離的平直劃痕，而且因?yàn)橛?條定位線，與劃痕相交，這樣就有10個(gè)固定監(jiān)測點(diǎn)，不作重復(fù)，誤差也很小。 Q: 非特異性影響，除了細(xì)胞遷移，實(shí)驗(yàn)還發(fā)生了細(xì)胞增殖的變化 A: 如果連續(xù)監(jiān)測 24 小時(shí)，需要考慮到劃痕縮小是細(xì)胞遷移和細(xì)胞繁殖共同作用的結(jié)果，而不是單純的細(xì)胞遷移。如果你要單純的考慮細(xì)胞遷移，你可以先用絲裂霉素(1 μg/ml)處理一小時(shí)，抑制細(xì)胞的分裂，這樣的結(jié)果就是細(xì)胞遷移的作用了。另外，使用無血清培養(yǎng)基也可以降低增殖對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。 Q: 細(xì)胞遷移之間的差異問題及細(xì)胞遷移速度 A: 在同一實(shí)驗(yàn)中，不同細(xì)胞的遷移速度和方式可能會(huì)有差異，這可能是由于細(xì)胞類型、培養(yǎng)條件以及實(shí)驗(yàn)操作等因素的影響。解決方案是在實(shí)驗(yàn)前篩選細(xì)胞系，確保使用相對一致的細(xì)胞群體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。雖然無血清培養(yǎng)可以忽略細(xì)胞增殖的影響，但是由于細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)整體性的下調(diào)節(jié)，細(xì)胞遷移的速度也會(huì)慢很多。

在腫瘤細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)中，常見的實(shí)驗(yàn)包括細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等。本期重點(diǎn)學(xué)習(xí)【細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)】，用于檢測細(xì)胞的增殖能力。   01 實(shí)驗(yàn)原理 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)是一種重要的技術(shù)方法，用于評估細(xì)胞的增殖能力、侵襲性以及對殺傷因素的敏感性等。 當(dāng)單個(gè)細(xì)胞在體外連續(xù)增殖達(dá)到6代以上時(shí)，其后代形成的細(xì)胞群體被稱為集落或克隆。細(xì)胞克隆形成率即細(xì)胞接種存活率，是指接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞成活并形成克隆的數(shù)量。貼壁后的細(xì)胞不一定每個(gè)都能增殖和形成克隆，而形成克隆的細(xì)胞必為貼壁和有增殖活動(dòng)的細(xì)胞。 克隆形成率反映了細(xì)胞群體的依賴性和增殖能力這兩個(gè)重要特征。     02 實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1）通過對細(xì)胞處理后在細(xì)胞培養(yǎng)板上的克隆形成能力來提示處理后細(xì)胞的增殖能力； 2）評價(jià)不同殺傷因素，如藥物或基因等對腫瘤細(xì)胞增殖能力或群體依賴性的敏感性； 3）評價(jià)在體內(nèi)成瘤性，癌細(xì)胞不一定都可以在體內(nèi)成瘤，但若體外克隆能力越強(qiáng)，即表明體內(nèi)成瘤性越強(qiáng)，算是模擬體內(nèi)成瘤的體外實(shí)驗(yàn)。   03 克隆形成實(shí)驗(yàn)分類與流程       克隆形成依據(jù)采用的培養(yǎng)介質(zhì)不同，分為平板克隆和軟瓊脂克隆兩類。   ——平臺克隆實(shí)驗(yàn)—— 6孔板 細(xì)胞處理：將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用胰酶消化，并重懸成細(xì)胞懸液，然后進(jìn)行計(jì)數(shù)； 細(xì)胞接種：將確定數(shù)量的細(xì)胞接種到6孔板中的各實(shí)驗(yàn)組，每孔接種400-1,000個(gè)細(xì)胞； 培養(yǎng)觀察：繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至14天或大多數(shù)克隆中的細(xì)胞數(shù)超過50個(gè)，每隔3天更換培養(yǎng)基并觀察細(xì)胞狀態(tài)； 固定與染色：克隆完成后，拍照記錄細(xì)胞形態(tài)，然后用PBS洗滌細(xì)胞，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞30-60分鐘，再次洗滌； 染色和拍照：加入結(jié)晶紫染液染色細(xì)胞10-20分鐘，再次用PBS洗滌細(xì)胞，晾干后用數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍照（整個(gè)板和每個(gè)孔分別拍照）。   平皿 細(xì)胞處理：取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，然后懸浮在完全培養(yǎng)基中備用； 細(xì)胞接種：每組細(xì)胞懸液按照梯度倍數(shù)稀釋，每組分別接種100個(gè)細(xì)胞到含有10ml 37℃預(yù)溫培養(yǎng)液的皿中，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)確保細(xì)胞均勻分散； 培養(yǎng)觀察：將培養(yǎng)皿放置在37℃、5% CO2和飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3周； 克隆觀察：當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，停止培養(yǎng)。用PBS小心洗滌細(xì)胞2次； 固定和染色：加入適量的固定液固定細(xì)胞，然后用染色液染色； 洗滌和干燥：用流水緩慢洗去染色液，使細(xì)胞干燥； 克隆計(jì)數(shù)：在帶網(wǎng)格的透明膠片上，用肉眼計(jì)數(shù)可見克隆，或在低倍顯微鏡下計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)； 統(tǒng)計(jì)與分析：計(jì)算克隆形成率，克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）*100%。   ——軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)——       軟瓊脂克隆形成（Soft agar colony formation）又稱為非錨定依賴性生長實(shí)驗(yàn)(Anchorage-independent assay)，利用軟瓊脂作為培養(yǎng)介質(zhì)，使細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下生長。在這種實(shí)驗(yàn)中，惡性腫瘤細(xì)胞具有貼壁生長和懸浮生長的能力，通過軟瓊脂中形成克隆的能力反映了其惡性程度，因此可以用于細(xì)胞分化的基礎(chǔ)研究以及評估臨床腫瘤治療的療效等方面。 配制1.2%和0.7%瓊脂，高壓滅菌； 將1.2%瓊脂與2×培養(yǎng)基混合，鋪入6孔板底部，37°C孵育30分鐘使其凝固； 將單細(xì)胞懸液與0.7%瓊脂混勻，加入6孔板作為上層膠，每孔1.5ml。加入培養(yǎng)基后，每3天更換一次； 孵育2-3周后，使用顯微鏡觀察克隆的大小，并拍照。如果拍攝整個(gè)孔，可在每孔加入200μl氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)染色，37°C過夜后拍照； 統(tǒng)計(jì)與分析：計(jì)算克隆形成率，克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）*100%。    

新手如何做好ELISA實(shí)驗(yàn)? 這個(gè)問題問得好，她會(huì)得到滿意的檢查結(jié)果嗎？ 以及應(yīng)該注意哪些預(yù)防措施？ 讓我們看看 ELK 實(shí)驗(yàn)室錄制的視頻。

高背景/非特異性染色 結(jié)果描述   可能的原因 建議及預(yù)防措施 終止后,整板結(jié)果顯現(xiàn)均一的黃色或淡色;或標(biāo)曲有線性但背景過高 整版發(fā)黃現(xiàn)象可能由于錯(cuò)加其他試劑造成 實(shí)驗(yàn)前檢查試劑的組分及批號,確認(rèn)所有組分均屬于對應(yīng)的試劑盒.不同試劑盒或不同批號 未充分清洗酶標(biāo)板 確保清洗過程中每個(gè)微孔所加入洗滌液量一致.清洗完成后,將酶標(biāo)板用力按壓在吸水紙上,以除去殘余的緩沖液. 孵育時(shí)間過長 請嚴(yán)格按照說明書步驟操作 酶標(biāo)記物污染了吸頭及盛放顯色劑容器或陽性對照污染了微孔 吸取不同的試劑時(shí)應(yīng)更換吸頭,配置不同的試劑組分時(shí),應(yīng)使用不同的儲存器皿,操作時(shí)請使用移液器 檢測抗體貨Avidin-HRP的濃度過高 檢查濃度計(jì)算是否正確或進(jìn)一步稀釋后再使用 底物在使用前曝光或污染 加入底物前,應(yīng)始終避光保存 顯色時(shí)間過長 請嚴(yán)格按照說明書步驟操作 讀取了吸光值時(shí)使用了錯(cuò)誤的濾光片 TMB為底物時(shí)應(yīng)在450nm波長讀取吸光值,并以650nm作為校正波長   白板 結(jié)果描述   可能的原因 建議及預(yù)防措施 顯色步驟結(jié)束后,酶標(biāo)板所有孔均無顏色;陽性對照不明顯 組分試劑混淆使用 配制或使用時(shí)應(yīng)看清楚標(biāo)簽 洗版及加樣過程中,酶標(biāo)物受污染失活失去催化顯色劑顯色的能力 確認(rèn)盛酶標(biāo)的容器不含酶抑制劑(如NaN3等),確認(rèn)配制洗液的容器已洗干凈. 遺漏了某種試劑或某個(gè)步驟 詳細(xì)審閱說明書,并嚴(yán)格遵循操作步驟   顯色淡 結(jié)果描述   可能的原因 建議及預(yù)防措施 包括標(biāo)曲、樣本在內(nèi)的所有板孔顏色均較淡 試劑盒超過有效期或儲存不當(dāng) 請?jiān)谟行趦?nèi)使用,并按照說明書推薦的保存條件保存,避免污染 試劑、樣品用前未平衡 所有試劑、樣品應(yīng)置室溫平衡30min左右 移液器吸量不足,移液抽吸排放太快,吸頭內(nèi)壁掛液太多或內(nèi)壁不清潔 校正移液器,吸頭要配套,每次吸頭要吻合緊密,移液不宜過快,排放應(yīng)完全.吸頭內(nèi)壁要清潔,最好一次性使用. 孵育反應(yīng)時(shí)間不足 定時(shí)器準(zhǔn)確定時(shí) 顯色反應(yīng)不足 一般在15-30min 洗滌次數(shù)增加,濃縮洗液稀釋倍數(shù)不符合要求 減少洗滌沖擊力,按照說明書要求稀釋濃縮洗液、洗滌時(shí)間,準(zhǔn)確記錄洗滌次數(shù)及用量 蒸餾水水質(zhì)有問題 配置好的洗液一定要檢測PH值是否呈中性 洗板及加樣過程中,酶標(biāo)物受污染失活而失去催化顯色劑顯色的能力 確認(rèn)盛酶標(biāo)的容器不含酶抑制劑(如NaN3等),確認(rèn)配制洗液的容器已經(jīng)洗干凈,確認(rèn)配置洗液的純化水達(dá)到要求且未受污染. 標(biāo)曲正常,樣本顯色較淡 樣本使用NaN3防腐劑,抑制了酶的反應(yīng) 樣本不可使用NaN3   待測樣本中可能不含強(qiáng)陽性標(biāo)本,故結(jié)果可能是正常的 如有懷疑,可以復(fù)檢 目測結(jié)果正常,但酶標(biāo)儀讀值偏低 讀取吸光值時(shí)使用了錯(cuò)誤的濾光片 TMB為底物時(shí)應(yīng)在450nm波長讀取吸光值,并以650nm作為校正波長   標(biāo)準(zhǔn)曲線不佳/重復(fù)性不好 結(jié)果描述   可能的原因 建議及預(yù)防措施 重復(fù)性差 標(biāo)準(zhǔn)品配制有誤 嚴(yán)格按照說明書標(biāo)準(zhǔn)品配制進(jìn)行操作,僅使用推薦的稀釋液對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋 試劑盒儲存方法不當(dāng)或儲存環(huán)境太差 請?jiān)谡f明書推薦的條件下保存,不要將重懸后的組分在室溫放置時(shí)間過長 過早稀釋各工作組分 各工作組分請?jiān)谑褂们?0分鐘配置,并立即加入到微孔中 樣本加入后未混勻 針對同時(shí)加入多種試劑組分,加樣后在混勻器上充分混勻,注意穩(wěn)拿穩(wěn)放,防止外濺 酶標(biāo)儀測定重復(fù)性差 校準(zhǔn)酶標(biāo)儀 孵育時(shí)間、洗滌條件、顯色條件、操作人員不一致 重復(fù)測定標(biāo)本,反應(yīng)條件、人員等盡可能與上次保持一致 洗滌不正確 移液器準(zhǔn)確加入200µl/孔洗滌液或注滿各孔,但不要溢出.洗板機(jī)洗板時(shí)不應(yīng)有堵孔,洗滌應(yīng)充分 孵育溫度恒溫效果不好 保持溫度恒定,避免局部溫度過高過低 加液時(shí),過多殘留于孔壁上 加液時(shí),吸頭在不碰到孔底的前提下盡量沿著孔壁下方加液 耗材重復(fù)使用 吸取不同的試劑時(shí)應(yīng)更換吸頭,配置不同的試劑組分時(shí),應(yīng)使用不同的儲液器皿 微孔底部被劃傷或者存在污垢 操作時(shí)細(xì)心,注意不要觸碰底部擦拭酶標(biāo)板底部,以去除污垢或者指紋 閾值附近時(shí)陰時(shí)陽 同一樣品做3個(gè)復(fù)孔,以2個(gè)(含2個(gè)以上相同結(jié)果為準(zhǔn)) 加樣時(shí)交叉污染 加標(biāo)本時(shí)盡量避免交叉污染 出現(xiàn)隨機(jī)性的花板、跳孔現(xiàn)象 手工洗板造成的交叉污染 手工洗板時(shí)前3次注洗液后應(yīng)立即棄去,后幾次再設(shè)定浸泡時(shí)間,可以減少交叉污染 拍板時(shí)交叉污染 拍板時(shí)用合適的吸水紙巾,不要把無關(guān)物質(zhì)拍進(jìn)板孔,并盡量不要在同一位置拍,以免交叉污染 洗板機(jī)加液頭堵塞導(dǎo)致加液不滿或吸液殘留量較大,造成花板、跳孔 疏通加液頭,使洗板時(shí)每孔均注滿洗液,吸液時(shí)殘留量要小 樣本離心處理不全,致使反應(yīng)孔內(nèi)發(fā)生凝血現(xiàn)象或存在沉淀物或殘留細(xì)胞成分干擾 血清血漿應(yīng)充分離心,3000rpm 6min以上 樣品放置時(shí)間過長,污染 樣品應(yīng)保持新鮮,或低溫保存,防止污染 洗滌液配制有誤或直接誤用濃縮洗滌液 請按說明書配置