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如何高效完成細(xì)胞克隆形成實驗？
供稿：恒意賽
發(fā)布時間：2024-06-11
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在腫瘤細(xì)胞功能實驗中，常見的實驗包括細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等。本期重點學(xué)習(xí)【細(xì)胞克隆形成實驗】，用于檢測細(xì)胞的增殖能力。
01 實驗原理
細(xì)胞克隆形成實驗是一種重要的技術(shù)方法，用于評估細(xì)胞的增殖能力、侵襲性以及對殺傷因素的敏感性等。
當(dāng)單個細(xì)胞在體外連續(xù)增殖達(dá)到6代以上時，其后代形成的細(xì)胞群體被稱為集落或克隆。細(xì)胞克隆形成率即細(xì)胞接種存活率，是指接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞成活并形成克隆的數(shù)量。貼壁后的細(xì)胞不一定每個都能增殖和形成克隆，而形成克隆的細(xì)胞必為貼壁和有增殖活動的細(xì)胞。
克隆形成率反映了細(xì)胞群體的依賴性和增殖能力這兩個重要特征。
02 實驗?zāi)康?/strong>
1）通過對細(xì)胞處理后在細(xì)胞培養(yǎng)板上的克隆形成能力來提示處理后細(xì)胞的增殖能力；
2）評價不同殺傷因素，如藥物或基因等對腫瘤細(xì)胞增殖能力或群體依賴性的敏感性；
3）評價在體內(nèi)成瘤性，癌細(xì)胞不一定都可以在體內(nèi)成瘤，但若體外克隆能力越強(qiáng)，即表明體內(nèi)成瘤性越強(qiáng)，算是模擬體內(nèi)成瘤的體外實驗。
03 克隆形成實驗分類與流程
克隆形成依據(jù)采用的培養(yǎng)介質(zhì)不同，分為平板克隆和軟瓊脂克隆兩類。
——平臺克隆實驗——
| 6孔板 |
| 細(xì)胞處理：將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用胰酶消化，并重懸成細(xì)胞懸液，然后進(jìn)行計數(shù)； |
| 細(xì)胞接種：將確定數(shù)量的細(xì)胞接種到6孔板中的各實驗組，每孔接種400-1,000個細(xì)胞； |
| 培養(yǎng)觀察：繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至14天或大多數(shù)克隆中的細(xì)胞數(shù)超過50個，每隔3天更換培養(yǎng)基并觀察細(xì)胞狀態(tài)； |
| 固定與染色：克隆完成后，拍照記錄細(xì)胞形態(tài)，然后用PBS洗滌細(xì)胞，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞30-60分鐘，再次洗滌； |
| 染色和拍照：加入結(jié)晶紫染液染色細(xì)胞10-20分鐘，再次用PBS洗滌細(xì)胞，晾干后用數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍照（整個板和每個孔分別拍照）。 |
| 平皿 |
| 細(xì)胞處理：取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細(xì)胞，然后懸浮在完全培養(yǎng)基中備用； |
| 細(xì)胞接種：每組細(xì)胞懸液按照梯度倍數(shù)稀釋，每組分別接種100個細(xì)胞到含有10ml 37℃預(yù)溫培養(yǎng)液的皿中，輕輕轉(zhuǎn)動確保細(xì)胞均勻分散； |
| 培養(yǎng)觀察：將培養(yǎng)皿放置在37℃、5% CO2和飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3周； |
| 克隆觀察：當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，停止培養(yǎng)。用PBS小心洗滌細(xì)胞2次； |
| 固定和染色：加入適量的固定液固定細(xì)胞，然后用染色液染色； |
| 洗滌和干燥：用流水緩慢洗去染色液，使細(xì)胞干燥； |
| 克隆計數(shù)：在帶網(wǎng)格的透明膠片上，用肉眼計數(shù)可見克隆，或在低倍顯微鏡下計數(shù)大于10個細(xì)胞的克隆數(shù)； |
| 統(tǒng)計與分析：計算克隆形成率，克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）*100%。 |
——軟瓊脂克隆實驗——
軟瓊脂克隆形成（Soft agar colony formation）又稱為非錨定依賴性生長實驗(Anchorage-independent assay)，利用軟瓊脂作為培養(yǎng)介質(zhì)，使細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下生長。在這種實驗中，惡性腫瘤細(xì)胞具有貼壁生長和懸浮生長的能力，通過軟瓊脂中形成克隆的能力反映了其惡性程度，因此可以用于細(xì)胞分化的基礎(chǔ)研究以及評估臨床腫瘤治療的療效等方面。
| 配制1.2%和0.7%瓊脂，高壓滅菌； |
| 將1.2%瓊脂與2×培養(yǎng)基混合，鋪入6孔板底部，37°C孵育30分鐘使其凝固； |
| 將單細(xì)胞懸液與0.7%瓊脂混勻，加入6孔板作為上層膠，每孔1.5ml。加入培養(yǎng)基后，每3天更換一次； |
| 孵育2-3周后，使用顯微鏡觀察克隆的大小，并拍照。如果拍攝整個孔，可在每孔加入200μl氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)染色，37°C過夜后拍照； |
| 統(tǒng)計與分析：計算克隆形成率，克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）*100%。 |
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