石蠟包埋，石蠟切片實驗步驟

 

1.清理切片：石蠟切片置于65℃烘箱中烘片2h,將切片上的石蠟融化，取出切片，在切片上做好標(biāo)記將所要做的指標(biāo)GLUT4寫在切片上，將做好標(biāo)記的切片放在玻片架上。

2.脫蠟至水：依次將裝有切片的玻片架放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-無水乙醇Ⅰ10min-無水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸餾水洗。

3.PBS洗：將切片從玻片架上轉(zhuǎn)移到修復(fù)盒內(nèi)，并用PBS洗三次，每次5 min。

4.修復(fù)：將新鮮配置的EDTA修復(fù)液倒入修復(fù)盒內(nèi)，用透明膠帶將修復(fù)盒封好，將封好的修復(fù)盒放入微波爐中修復(fù)，調(diào)至中火至沸后斷電，間隔10min后調(diào)至低火至沸。

5.冷卻：將修復(fù)好的修復(fù)盒拿出來，打開蓋子，自然冷卻至室溫，然后用PBS洗3次，每次5 min。

6.H2O2封閉：將配置好的濃度為3%H2O2溶液倒入修復(fù)盒中，蓋好蓋子，室溫下避光孵育10min。

7.畫圈：將封閉好的切片用PBS洗3次，每次5 min，然后用組化筆將在玻片上畫圈，將組織圈起來。防止加在組織上的試劑流失。

8.BSA封閉：將畫好圈的切片甩干后放在濕盒內(nèi)，在組織上滴加5% BSA封閉20min，每個組織上滴加約100ul。

9.加一抗：甩去切片上的BSA液，不經(jīng)PSB洗，每張切片加入約50μl用5%BSAl稀釋的一抗（GLUT4稀釋比：1:100）覆蓋組織，放入4℃冰箱過夜。

10.復(fù)溫：第二天早上取出濕盒，打開濕盒讓切片在室溫下復(fù)溫30min。

11.洗去一抗：用PBS沖洗掉組織上的一抗，將切片放入修復(fù)盒內(nèi)，用PBS洗3次，每次5 min。

12.加二抗：將切片從修復(fù)盒中取出，甩去切片上PBS液，放入濕盒內(nèi)，然后每張切片加100μl用5%BSA稀釋的二抗（稀釋比：1:200），將濕盒放入恒溫水浴箱37℃孵育50min。

13.洗去二抗：將濕盒取出，用PBS沖洗切片上二抗，將切片放入修復(fù)盒內(nèi)用PBS洗3次，每次5min。

14.顯色：甩去切片上PBS液，每張切片加50-100μl新鮮配制DAB顯色液，在普通光學(xué)顯微鏡100倍視野下控制顯色，顯色完成用PBS將顯色液沖洗掉來終止顯色。

15.復(fù)染：顯色完成后，將切片放在玻片架上用蒸餾水或自來水沖洗，用Mayer蘇木素復(fù)染5min，自來水沖洗返藍5min，流水沖洗。

16.脫水透明封片：將玻片架依次放入95%酒精I 5min -95%酒精II 5min-無水乙醇Ⅰ5min -無水乙醇Ⅱ5min -二甲苯Ⅰ5min -二甲苯Ⅱ5min中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片。

17.拍照選取視野：將封固好的切片晾干后，置于倒置顯微鏡用200倍視野選取視野，每個組織片選取三個200倍視野來進行統(tǒng)計分析。